革兰氏染色是一种在微生物学中广泛应用的细菌分类方法，由丹麦科学家汉斯·克里斯蒂安·格兰（Hans Christian Gram）于1884年发明。该方法通过不同的染色反应将细菌分为两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这种分类方式不仅有助于细菌的初步鉴定，也为后续的临床诊断和治疗提供了重要依据。

一、革兰氏染色的基本原理

革兰氏染色的核心在于细菌细胞壁结构的差异。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖组成，且含有较多的磷壁酸；而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，外层为脂多糖和蛋白质组成的外膜，内部则含有较少的肽聚糖。

在染色过程中，首先使用结晶紫对所有细菌进行染色，随后加入碘液作为媒染剂，使染料与细胞壁中的成分结合。接下来，使用酒精或丙酮进行脱色处理，这一过程是区分两类细菌的关键步骤。由于革兰氏阳性菌的细胞壁结构致密，能够保留染料，因此在脱色后仍呈现紫色；而革兰氏阴性菌的细胞壁较为疏松，容易被脱色剂洗去颜色，最终在复染时被复红或其他红色染料染成红色。

二、革兰氏染色的操作步骤

1. 制片

取少量待测细菌样本，在载玻片上均匀涂布，使其形成一层薄薄的菌膜。随后将载玻片在火焰上加热固定，以杀死细菌并增强其与载玻片的附着力。

2. 初染（结晶紫染色）

将载玻片放置在染色架上，用结晶紫溶液覆盖整个菌膜，染色约1分钟。之后用蒸馏水轻轻冲洗，去除多余的染色液。

3. 媒染（碘液处理）

在载玻片上滴加碘液，作用约1分钟，使结晶紫与细胞壁中的成分结合，形成复合物。随后再次用水冲洗，去除未结合的碘液。

4. 脱色

使用95%的乙醇或丙酮进行脱色，时间控制在10-30秒之间。此步骤需根据实验经验灵活掌握，避免过度脱色或脱色不足。

5. 复染（复红染色）

在脱色后的载玻片上滴加复红染色液，染色约1分钟后，用水冲洗干净，使未被染色的细菌呈现红色。

6. 干燥与观察

将载玻片自然晾干或用吸水纸轻压吸干水分，然后置于显微镜下观察。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

三、注意事项

- 染色过程中应严格控制各步骤的时间，尤其是脱色环节，过长或过短都会影响染色结果。

- 样本制备要均匀，避免菌体聚集，以免影响观察效果。

- 染色试剂需新鲜配制，避免因保存不当导致染色失败。

四、应用价值

革兰氏染色不仅在基础研究中具有重要意义，还在临床医学、食品卫生、环境监测等多个领域得到广泛应用。通过对细菌的快速分类，可以为疾病的诊断、抗生素的选择以及污染源的追踪提供科学依据。

总之，革兰氏染色是一项简单但高效的细菌鉴别技术，其原理清晰、操作规范，是微生物学研究中不可或缺的基础技能之一。